Подвизался сначала в пустыне. Но узнав о гонении императора Валента (364-378 гг.) на православных, преподобный Исаакий пришел в Константинополь, где ревностно боролся за чистоту Православия. Имея от Бога дар пророчества, предсказал императору Валенту бесславный исход похода против готфов. Когда император выходил с войском из столицы, преподобный Исаакий громко обратился к нему: «Царь, отопри храмы православным, и тогда Господь поможет тебе!» Но император, не обращая внимания на слова монаха, самоуверенно продолжал путь. Трижды повторял преподобный свою просьбу и пророчества. Рассерженный император приказал бросить его в глубокий овраг, поросший колючим терновником. На дне оврага было болото, выйти из него было невозможно. Но преподобный с помощью Божией остался жив, вышел, догнал императора и сказал: «Ты хотел погубить меня, но святые Ангелы вывели меня. Послушай меня, открой храмы православным и победишь врагов своих. Если же не послушаешь меня, то не возвратишься живым, но погибнешь в огне». Император удивился смелости старца, которого приказал держать в заключении до его возвращения.
Предсказание святого исполнилось: преследуемый варварами император обратился в бегство и скрылся в сарае с соломой. Варвары, узнав об этом, сожгли сарай. После известия о гибели императора преподобного Исаакия освободили и стали почитать как пророка Божия.
Когда на престол был избран царь Феодосий Великий (379-395 гг.), он призвал к себе старца, встретил его с великой честью, просил святых молитв и исполнил все его наставления: изгнал ариан из Константинополя и возвратил православным храмы. По совету преподобного Исаакия был созван II Вселенский Собор, на котором святой выступал как решительный противник арианства. Преподобный хотел возвратиться в пустыню, но приближенные императора упросили его не уходить из города и ограждать его молитвами. В предместье Константинополя они построили для святого жилище, куда к нему собрались иноки. Так возникла обитель, игуменом и духовным наставником в которой был преподобный Исаакий. Он окормлял также и мирян, много помогал бедным и страждущим.
Достигнув глубокой старости, поставил вместо себя игуменом святого Далмата (IV-V вв.; память 3/16 августа), по имени которого стал называться монастырь. Скончался преподобный Исаакий в 383 г. Его имени посвящен великолепный собор в Санкт-Петербурге.